Читать онлайн Цитология и гистология бесплатно

Введение

Термин гистология (hystos – ткань и logos – слово) переводится как учение о тканях. Однако курс гистологии не ограничивается изучением только тканей, он включает в себя четыре взаимосвязанных раздела: цитология, общая гистология, эмбриология и частная гистология.

В данном пособие рассматривается цитология и гистология. Цитология посвящена общим закономерностям строения эукариотической клетки как основной структурно-функциональной единицы живого и ее жизненным проявлениям (делению, обмену веществ, движению и пр.).

Эмбриология рассматривает в сравнительном морфологическом плане прогенез, онтогенез хордовых и позвоночных животных.

Общая гистология изучает закономерности строения и функций четырех основных типов тканей, их классификацию и источники развития, а также реализацию клетками зародышевых листков и зачатков гистобластических и гистотипических потенций в процессе онтогенеза.

Частная гистология изучает не только структурные особенности клеток и тканей, но и многотканевое строение органов и функциональную специфику тканевых и органных систем. При изложении материала учтено, что все клеточные и тканевые структуры находятся в состоянии непрерывного развития, соподчиненности и функциональной взаимосвязи.

Знание нормального строения тканей необходимо, чтобы понимать происходящие в организме реактивные и патологические изменения, диагностировать патологию и прогнозировать результаты лечения. Современная гистология основывается на самых последних достижениях молекулярной биологии, физиологии, биохимии, генетики и использует новейшие методы исследования; она служит фундаментом для многих дисциплин, связанных с клинической практикой (анатомия и физиология животных, патологическая физиология, патологическая анатомия, паразитология, хирургия и другие).

В задачи гистологии входит:

1) дальнейшее изучение эмбрионального и постэмбрионального гистогенеза и провизорных органов у филогенетически различающихся животных;

2) выяснение особенностей развития межтканевых и межклеточных взаимоотношений, роли нервной, эндокринной и иммунной систем в регуляции процессов гисто – и морфогенеза;

3) уточнение влияния экзогенных и эндогенных факторов окружающей среды на дифференцировку и развитие тканей в онтогенезе;

4) дальнейшее изучение различных типов регенераций тканей (физиологической, репаративной, абортивной).

1 Краткий очерк развития цитологии и гистологии

Гистология как наука о тканях зародилась задолго до создания микроскопа. Результаты расчленения организма животных и человека встречаются в трудах Аристотеля, Клавдия Галена, Авиценны и других, живших до нашей эры. Однако эти исследования основывались только на макроскопическом визуальном изучение объектов, поэтому при попытке создания классификации в одну и ту же группу ошибочно попадали неродственные ткани и органы, например, сухожилия и нервы. В первой половине ХVII делались попытки изучения структур, невидимых простым глазом, с помощью увеличительных стекол (лупы). В середине ХVII века английский физик Роберт Гук, благодаря усовершенствованному микроскопу увидел пустоты в пробке и впервые применил к ним термин «клетка».

Большой вклад в развитие микроскопии внес голландский оптик Антоний ван Левенгук, который в 1667 году разработал микроскоп, способный увеличивать изображение в 300 раз. Им были описаны красные кровяные тельца и их движение в капиллярах, спермии, поперечнополосатые мышцы, нервы, сухожилия, также первые простейшие организмы, обнаруженные в капле воды. Итальянский ученый Марчелло Мальпиги изучил строение кожи, селезенки, почки и др. Однако открытия в области гистологии носили случайный характер, а из-за малой разрешающей способности микроскопа часто были артефактами. Интерес к микроскопии ослаб и в силу господствующего в те времена метафизического представления о природе. Человек, согласно этому учению преобразован (преформирован) в спермии или яйцеклетке.

В противоположность преформизму в науке развивалась и теория эпигенеза, согласно которой организм животного не преобразован в половых клетках, а формируется в процессе своею развития заново. Основоположником этой теории был К.Ф. Вольф, переехавший в 1760 году из Германии в Россию и много лет проработавший в Петербургской Академии паук. К.Ф. Вольф вполне обоснованно считал, что организм всегда развивается из вещества яйцеклетки путем предобразования органов. Он первым наблюдал формирование органов из листовидных пластинок (зародышевых листков), изучил и описал развитие сердца и почек (таким образом, его можно считать родоначальником теории происхождения тканей из зародышевых листков).

Следующий этап развития гистологии был связан с дальнейшим усовершенствованием ахроматического микроскопа. В теоретических разработках последнего участвовали академики Леопард Эйлер, Ф.У.Т. Эпинус из Санкт-Петербурга. Активное становление гистологии начинается с 30-х годов XVIII столетия. Среди ученых успешно продолжающих микроскопические исследования клеток, или «комочков», различных тканей животных, был и Ян Евангелиста Пуркинье. Изучая яйцо курицы, он впервые описал (1825-1827), главный органоид клетки – ядро, а также нейроны головного мозга, которые затем были названы его именем – клетки Пуркинье. Большой вклад в изучение структуры клеток и тканей различных животных внесли такие выдающиеся ученые как Роберт Броун, Габриэль Валентин, П.Ф. Горянинов, Якоб Генле, Роберт Ремак, Матгиас Якоб Шлейден, Теодор Шванн и другие.

Теодор Шванн, приняв ядро за критерий клеточного строения, смог составить элементарные структуры растений и животных и создать клеточную теорию, которая явилась величайшим открытием в биологии. Суть ее сводилась к следующему: клетки растений и животных принципиально сходны, имеют единый план строения, происхождения и гомологичны друг другу. Начиная с этого времени, гистология стала развиваться как наука. Значение клеточной теории для биологии можно сравнить с двумя другими великими открытиями – законом сохранения энергии и эволюционной теорией Дарвина. Большую роль в развитии клеточной теории Шванна сыграли труды выдающегося патологоанатома и патогистолога Р. Вирхова. Крылатым стал его афоризм «omnis cellula e cellula» – «клетка от клетки». Он показал, что в основе патологических процессов (воспаления, дистрофии, новообразований) лежат изменения клеток.

Важнейшим достижением гистологической техники в середине XIX века стало создание микротома (Я.Е. Пуркинье), позволяющего готовить тонкие срезы, введение в практику водных и иммерсионных объективов. В этот период были открыты процессы кариокинеза в растительных и животных клетках (И.Д. Чистяков, 1874; П.И. Перемежко, 1878; Вальтер Флеминг, 1879 – 1882), обнаружены клеточный центр, сетчатый аппарат (К. Гольджи, 1898), тонофибриллы, хондросомы, митохондрии, миофибриллы, то есть была охарактеризована структура цитоплазмы и ее органелл. Таким образом, к концу XIX столетия в отдельный раздел гистологии выделилось учение о клетке – цитология. Сегодня постулаты клеточной теории звучат следующим образом:

– клетка является наименьшей единицей живого. Этот первый постулат клеточной теории был сформулирован Г. Шванном (1839) и Р. Вирховым (1858). Только на клеточном уровне проявляются в совокупности признаки живого: способность к репродукции, превращению энергии, метаболизм, чувствительность, адаптация к меняющимся условиям изменчивость и другие;

– сходство клеток разных организмов по строению (гомология) обусловлено единообразием общеклеточных функций, направленных на поддержание жизнедеятельности клеток и клеточных популяций;

– клетки размножаются путем деления исходной клетки (третий постулат, сформированный Р. Вирховым в 1855 г., является биологическим законом). Перед делением в исходной клетке происходит удвоение генетического материала (ДНК), образуется специальный аппарат клеточного деления, с помощью которого удвоившиеся хромосомы равномерно распределяются между дочерними клетками. Поэтому митотическое деление эукариотических клеток является единственным полноценным клеточным делением;

– клетка представляет собой часть целостного организма. Находясь в составе тканей и органов, специализированные клетки взаимосвязаны и подчиняются межклеточным, гуморальным, эндокринным и нервным формам регуляции. Таким образом, элементарные единицы организма – клетки – интегрируются в целостные системы тканей и органов, а последние составляют организм, как единое целое.

В России XIX века наиболее интенсивные гистологические исследования проводились в Москве, Казани, Харькове, Томске. На медицинских факультетах университетов появляются самостоятельные кафедры гистологии, складываются гистологические школы с определенными научными направлениями. Возглавлявший кафедру гистологии медико-хирургической академии в Петербурге Н.М. Якубович исследовал микроскопическое строение центральной и периферической нервной системы. Ему удалось дифференцировать различные виды нейронов коры головного мозга (ядра Якубовича). На кафедре гистологии Московского университета под руководством А.И. Бабухина успешно разрабатывали вопросы развития и функций органов нервной системы (сетчатки глаза, электрического органа рыб и др.). И.Ф. Огнев изучал влияние на организм внешних и внутренних факторов. В Киевском университете исследования сотрудников кафедры, возглавляемой П.И. Перемежко, были направлены на изучение развития зародышевых листков и органов зародыша (глаз, надпочечников, селезенки, печени, щитовидной и поджелудочной железы, кровеносных сосудов, мышечных тканей и других структур).

В Казани нейрогистологические исследования активно проводились под руководством К.А. Арнштейна, А.С. Догелем, А.Е. Смирновым, Д.А. Тимофеевым, А.Н. Миславским, Б.И. Лаврентьевым, Н.Г. Колосовым, И.Ф. Ивановым, П.А. Ковальским и др.

Организатором кафедры гистологии Томского университета в 1888 г. стал замечательный нейрогистолог, ученик К.А. Арнштейна – А.С. Догель. В 1895 году Догеля избрали заведующим кафедрой гистологии Петербургского университета, которой прославленный ученый руководил до конца своей жизни. Он изучал тонкое строение чувствительных нервных узлов, выявил свыше десяти типов нейронов, а также сложные перицеллюлярные сплетения. На своих прекрасно изготовленных препаратах продемонстрировал все известные ныне чувствительные окончания в тканях и органах. В 1898 году в вегетативных ганглиях им были обнаружены два типа нейронов. Метод суправитальной окраски нервных элементов метиленовым синим, предложенный А.С. Догелем, остается классическим. Заслугой А.С. Догеля можно считать и основание журнала «Русский архив анатомии, гистологии, эмбриологии», который нашел признание и за рубежом.

В области цитологии следует отметить разработку ленинградскими учеными проблемы паранекроза (Институт цитологии АН СССР). Предложенный Д.Н. Насоновым и В.Я. Александровым метод определения паранекротического («пограничного между жизнью и смертью») состояния клетки путем прижизненного окрашивания ее нейтральным красным, широко применяют в медицине (с его помощыо тестируют пригодность трансплантатов роговицы и т.п.), в сельском хозяйстве (определяют жизнеспособность семян). За монографию «Реакция животного вещества на внешние воздействия» (1940) оба ученых были удостоены Государственной премии.

В середине XIX века исследования К.Ф. Вольфа, X.И. Пандера и К.Э. Бэра послужили основой современной эмбриологии. Крупнейшие русские ученые И.И Мечников и А.О. Ковалевский, изучавшие в сравнительном плане микроскопическое строение и развитие тканей беспозвоночных и низших позвоночных животных, заложили фундамент эволюционной гистологии и эмбриологии.

Исследованиям в области клетки большое внимание уделяли ленинградские морфологи А.В. Немилов, 3.С. Кацнельсон, Б.И. Лаврентьев, А.А. Заварзин и другие. В Ленинградском университете структуру и функции ядра и других органоидов клетки изучали А.Я. Колачев, Д.Н. Насонов, В.Я. Александров, П.В. Макаров (например, в 20-х годах XX века Д.Н. Насонов показал, что в процессах секреции участвует аппарат Гольджи). Ценные для цитологии данные были получены Л.Н. Жинкиным и Г.С. Стрелыниковым при исследовании нейрогуморальной регуляции клеточного деления: ученые доказали, что механизмы реактивного торможения митотической активности возникают лишь на определенных стадиях онтогенеза.

Большой заслугой гистологов России (академики А.А. Заварзин и Н.Г. Хлопин) можно считать создание первых теорий тканевой эволюции, что способствовало успешному развитию эволюционной гистологии, характеризующейся историческим подходом к изучению тканевых структур.

Как известно, в гистологии общепринята морфофизиологическая классификация тканей, предложенная еще в XIX в. немецкими учеными Францем Лейдигом и Рудольфом Альбертом Кёлликером. Глубокое эволюционнотеоретическое обоснование этой системе дал А.А. Заварзин в 1945 году. По его представлению, филогенетическое развитие тканей в рамках четырех групп тканей (эпителиальные, соединительные, мышечные и нервные) обеспечило выполнение четырех элементарных функций многоклеточного организма: разграничительную, создание внутренней среды, реактивную и двигательную.

В 1943 году Н.Г. Хлопин предложил классифицировать ткани, исходя из генетического принципа. В основу своей генетической системы он положил не морфологические особенности нормально функционирующих тканей, а объем их «гистобластических потенций», то есть совокупность признаков, проявляющихся при различных условиях существования, в частности, в эксперименте при патологии. По мнению Н.Г. Хлопина, свойства каждой ткани определяются источником происхождения и путями ее развития. Генетическая система была прекрасно разработана на культурах ткани позвоночных животных. В классификации основное место занимает «тканевой тип» – система гистологических структур, которые развиваются по основному закону эволюционной морфологии, схематически изображенному в виде филогенетического дерева, при этом, ученый особо подчеркивал связь указанных структур с зародышевыми листками.

Особенно бурно развивалась гистология в советские годы в Москве и Ленинграде, где ученые занимались фундаментальными проблемами общей биологии.

При вузах были созданы НИИ и ЦНИЛы морфологии, Институт Мозга и другие. Общепризнанными авторитетами в области гистологии стали кафедры I МОЛМИ и Университета Дружбы народов, которыми руководил В.Г. Елисеев, создавший прекрасную гистологическую школу. Ученики В.Г. Елисеева (Ю.И. Афанасьев, Н.А. Юрина, М.Я. Субботин, В.А. Шахламов, А.И. Радостина и др.) сами стали руководителями крупных коллективов и кафедр морфологов. В Ленинграде получили дальнейшее развитие школы Н.Г. Хлопина (С.И. Щелкунов, А.Г. Кнорре, В.П. Михайлов, Б. Винников и др.), А.С. Догеля, А.А. Заварзина (А.А. Заварзин-мл., Д.И. Дейнека и др.), Н.Г. Колосова (В.Н. Швалев, В.Н. Майоров, А.А. Милохин и др.)

В военно-медицинской академии на кафедре гистологии продолжили экспериментальное изучение крови и соединительной ткани, начатые еще А.А. Максимовым направления. В педиатрическом институте всесторонне исследовали эмбриональный гистогенез тканей (А.Г. Кнорре, Л.В. Суворова). В Ленинградском ветеринарном институте с 1948 по 1983 год кафедрой гистологии руководил известный ученый, продолжатель идей школы А.С. Догеля, ученик А.В. Немилова – 3.С. Кацнельсон, внесший большой вклад в изучение проблемы гистогенеза и гистофизиологии надпочечников. В 1959 г. он опубликовал «Руководство к практическим занятиям по гистологии» для ветеринарных вузов, многократно переиздававшееся в стране.

В развитие возрастной, видовой и сравнительной гистологии сельскохозяйственных животных весомый вклад внесли ветеринарные гистологи: В.Я. Суетин, М.3. Атагимов, Г.Ш. Жанчипов, П.А. Ильин, А.Б. Панфилов, А. П. Попов, Л.П. Тельцов, П.М. Торгун и многие другие.

На развитие отечественной гистологии оказывают значительное влияние Оренбургские гистологи медицинской академии: А.А. Стадников, В.С. Полякова, Н.Н. Шевлюк и другие.

2 Методы исследования

Строение, развитие и функции клеток, и органов можно познать, только применяя разнообразные методы исследования. Гистологический анализ включает в себя следующие главные этапы: выбор объекта исследования, подготовку его для изучения под микроскопом (приготовление гистологических препаратов), микроскопирование препаратов (одним или несколькими методами), качественный и количественный анализ микроскопической картины. Объектами исследования могут служить живые или мертвые (фиксированные) клетки, ткани органов или их изображения на экране дисплея.

Методы исследования мертвых (фиксированных) клеток и тканей. Основой методов служит гистологический препарат.

Приготовление гистологического препарата. Гистологический препарат (постоянный) является основным объектом исследования для морфолога и представляет собой срез ткани (от 5 до 60 мкм), заключенный между предметным стеклом (толщиной от 2 до 3 мм) и покровным (от 0,18 до 0,2 мм). Материалом для исследования служат кусочки органов, мазки крови или слизи, отпечатки органа или оболочки мозга, стенка мочевого пузыря, брыжейка и т.п. (тотальные препараты).

Процесс приготовления гистологического препарата состоит из следующих этапов: взятие и фиксирование материала; его уплотнение; приготовление срезов на микротоме; их окрашивание (контрастирование); заключение срезов в бальзам или синтетические смолы.

Взятие и фиксирование материала. Максимальные размеры кусочков составляют 1x1x0,5 см; соотношение объема материала и фиксирующей жидкости должно быть не менее 1:9. Взятый из органа образец ткани погружают в фиксатор – простой 70 – 96 %-й спирт, 10 – 12 %-й формалин, растворы уксусной кислоты, бихромата калия, осмиевой кислоты или сложный (смеси простых фиксирующих жидкостей или солей тяжелых металлов в определенных пропорциях, обеспечивающие рН и молярность, близкие к таковым в организме). Действие фиксаторов проявляется в том, что в тканях и органах, в результате сложных биофизических процессов, происходит необратимая коагуляция белков, жизнедеятельность прекращается, то есть клеточные структуры становятся мертвыми. Они теперь находятся в том функциональном состоянии, в котором их застигла смерть, то есть зафиксированными. Фиксация приводит к некоторому уплотнению и уменьшению объема образца.

Уплотнение образцов ткани. Цель этого этапа – достичь высокой плотности и пластичности материала для того, чтобы приготовить из него тонкие срезы. Применяют уплотняющие среды – парафин, целлоидин, желатин, органические смолы или замораживание. Пропитка парафином продолжается от 1 до 4 ч, целлоидином – до 1 – 3 нед. Кусочек ткани предварительно обезвоживают (проводят через спирты возрастающей концентрации); затем спирт вытесняют промежуточной средой, способной смешиваться со спиртом и одновременно растворять уплотняющее вещество. При использовании парафина промежуточной средой служат циклические углеводороды (бензол, ксилол) или хлороформ. Для того, чтобы избежать перепада температур (парафин плавится при 60 °C) после вытеснения спирта ксилолом, образец выдерживают от 2 до 3 ч в смеси парафина с ксилолом при температуре 38 °C. Из уплотненного парафином образца вырезают блоки, из которых и готовят тонкие срезы, способные пропускать свет (что является необходимым условием для световой микроскопии). Наиболее тонкие срезы (толщиной от 5 до 7 мкм) удается изготовить из материала, залитого в парафин. Из образцов, уплотненных целлоидином, готовят срезы толщиной от 10 до 30 мкм. Срезы получают на санных или ротационных микротомах; для экспресс-диагностики (срезы толщиной от 40 до 60 мкм) – на замораживающем микротоме.

Окрашивание срезов. Срезы окрашивают, чтобы увеличить контрастность различных гистологических структур в препаратах, предназначенных для исследования в световом микроскопе. Разработаны разнообразные методы окраски. В процессе окрашивания происходят сложные химические и физические процессы, поэтому при выборе метода учитывают избирательное сродство структур клетки к определенным красителям с разными физико-химическими свойствами.

Все красители подразделяют на кислые, основные и специальные. Структуры срезов, хорошо окрашивающиеся кислыми красителями, называют оксифильными, основными красителями – базофильными окрашивающиеся как теми, так и другими – нейтрофильными. Специальные красители селективно выявляют конкретные структуры, обладающие сродством к ним. Наиболее широко распространен комбинированный метод окраски тканей – гематоксилином и эозином. Гематоксилин (основной краситель) окрашивает ядра клеток в синефиолетовый цвет, а эозин (кислый) – элементы цитоплазмы в розово-желтый. Окрашенные препараты обезвоживают в спиртах восходящей концентрации (50 %, 70 %, 96 %, 100 %), просветляют в ксилоле или некоторых маслах и затем каждый гистологический срез заключают между предметным и покровным стеклами в канадский бальзам или синтетические смолы. Готовый (постоянный) гистологический препарат можно хранить годами и использовать для микроскопирования.

Методы микроскопии. Основным инструментом для изучения гистологического препарата служит микроскоп – световой или электронный.

Световая микроскопия. С помощыо современных световых микроскопов (МБР-1 – микроскоп биологический рабочий, МБИ-1, МБИ-3 или МББИ – микроскоп бинокулярный биологический исследовательский, ЛЮМАМ и других) можно изучать на срезах строение клеток и тканей. Размер наименьшей структуры, которую можно увидеть в световом микроскопе, определяется наименьшим разрешающим расстоянием (d₀). У современных микроскопов оно составляет около 0,2 мкм. Приближенно разрешение, или разрешающую способность, можно рассчитать по формуле:

d₀=1/3λ, (1)

где λ – длина световой волны.

Для более точного расчета используют формулу, учитывающую конструкцию объектива:

где n – показатель преломления среды между препаратом и фронтальной линзой объектива;

sin α – синус угла между оптической осью и наиболее сильно отклоняющимся лучом, который еще попадает в линзу объектива.

В микроскопических исследованиях используют следующие единицы измерения:

– 1мкм (микрометр)=1×10^-3 мм = 1×10^-6 м;

– 1 нм (нанометр) = 1×10^-3 мкм = 1×10^-6 мм = = 1×10^-9 м;

– 1 Å (ангстрем) = 0,1 нм = 1×10^-4 мкм = 1×10^-7 мм = 1×10^-10 м.

Из приведенных данных видно, что разрешающая способность световых микроскопов ограничена десятыми долями микрона (микрометра). Структуры клетки меньшего размера можно рассмотреть только с помощью электронного микроскопа. Подробное описание светового и электронного микроскопов дано в соответствующих руководствах и в курсе физики.

Ультрафиолетовая микроскопия – представляет собой разновидность световой. Длина волны ультрафиолетовых лучей составляет около 0,3 мкм; разрешающая способность микроскопа при иммерсионном объективе приблизительно 0,1 мкм.

Люминесцентная микроскопия основана на том, что многие органические вещества, содержащиеся в клетках, способны светиться (флуоресцировать) при поглощении ими световой энергии. Спектр флуоресценции постоянно смещен в сторону более длинных волн по отношению к изучению, возбуждающему флуоресценцию. Этот спектр лежит в пределах коротких волн (длина от 0,25 до 0,4 мкм). Например, хлорофилл зеленых растений в ультрафиолетовых лучах светится красным светом, а другие вещества – зеленым или желтым (то есть с более короткими волнами). Этот принцип использован при создании люминесцентных микроскопов. Источником света в них служат ксеноновые или ртутные лампы (их спектр близок к ультрафиолетовому излучению), а объект исследуют через специальные фильтры.

Собственной, или первичной, флуоресценцией обладают пигменты (в том числе бактерий), витамины А и В₂, индоламины и некоторые другие вещества. Существует вторичная, или вызванная, флуоресценция. Чтобы ее получить, используют специальные вещества – флуорохромы, которые связываются различными структурами живой клетки и вызывают их флуоресценцию. Например, при обработке срезов тканей флуорохромом акридиновым оранжевым дезоксирибонуклеиновая кислота (ДНК) и ее производные приобретают яркозеленое свечение, а рибонуклеиновая кислота (РНК) и ее производные – яркокрасное. Разновидностью вторичной является флюоресценция желто-зеленого цвета, индуцированная парами формальдегида и характерная для катехоламинов (адреналин и норадреналин) мозгового вещества надпочечников. Таким образом, можно исследовать химический состав тканевых структур, выявлять трофические и секреторные включения в клетках.

Электронная микроскопия. В электронном микроскопе используются электронные лучи с более короткими, чем в световом микроскопе, длинами волн при напряжениях от 50000 до 100000 В. Длина волны электромагнитных колебаний, возникающих при движении потока или пучка электронов в условиях вакуума равна 0,0056 нм. Таким образом, разрешение достигает 0,002 нм или 0,000002 мкм, что в 100000 раз выше, чем в световом микроскопе. Разрешающая способность современных отечественных электронных микроскопов (ЭМВ-200, 300) и зарубежных (фирм Хитачи, Филипс) составляет не более от 1 до 5 А, однако на практике она не превышает от 0,2 до 0,5 нм, а для большинства биологических объектов от 1 до 2 нм. Методом электронной микроскопии исследуют ультратонкие срезы, толщиной от 500 до 1000 А, которые готовят на ультратомах – сложных электронных приборах, где ножами служат очень острые грани сломов зеркального стекла. Тончайшие срезы наносят на специальные металлические сетки с ячейками и помещают в вакуумную камеру электронного микроскопа. Обработка образцов тканей для ЭМ сходна с ранее описанной обработкой для световой микроскопии. Только здесь в качестве фиксаторов используют забуференные растворы параформа, тетроксида осмия, глютаральдегида (рН 7,0 – 7,4); образцы проводят через спирты восходящей концентрации и пропилен-оксид и заливают в синтетические смолы (аралдит, эпон или в их смесь). Чтобы более четко выявить, органеллы мембранного и немембранного типа в качестве контрастера применяют цитрат свинца и уранилацетат.

К современным электронно-микроскопическим методам относят просвечивающую, или трансмиссионную электронную микроскопию (ПЭМ), сканирующую электронную микроскопию (СЭМ) электронную авторадиографию, иммунно-электронную микроскопию, ЭМ-гистохимию.

СЭМ от ПЭМ отличается тем, что в первом электроны не проходят сквозь объект, а отражаются от его поверхности, сканируя ее. Сфокусированный пучок электронов, формируемый электронно-магнитными линзами, следует через отклоняющую катушку, которая перемещает его по поверхности препарата, покрытого тонким слоем металла (золотое или платиновое напыление). С поверхности препарата пучком выбиваются вторичные электроны, которые регистрируются и преобразуются в трехмерное изображение на экране. В отличие от ПЭМ для СЭМ можно использовать коррозийные препараты: объект изучения, например микроциркуляторное русло лимфатических сосудов, заливают какимилибо затвердевающими веществами и после этого просматривают слепки и его поверхности. Изучают также реплики, получаемые путем замораживания – скалывания. В этом случае исследуют слепок скола поверхности объекта. Чтобы увеличить контрастность, реплики необходимо оттенить с помощыо напыления частиц металлов (золота, платины) или угля.

Методы качественного и количественного анализа гистологических структур. Качественные гистохимические методы основаны на использовании реакций, с помощыо которых выявляют различные химические вещества в клетках тканей и органов. Зная, как распределяются в тканях белки, жиры, углеводы, ферменты и другие вещества в норме и при различных воздействиях на организм, можно судить с большей или меньшей вероятностью направленности метаболических процессов в исследуемых структурах. Современными гистохимическими методами обнаруживают в клетках аминокислоты, белки, нуклеиновые кислоты, углеводы, липиды, определяют активность различных ферментов, например в цикле Кребса. Выявление этих веществ основано на специфичности реакций между химическим реактивом и субстратом, входящим в состав клеточных и тканевых структур, и на выделении продуктов химических реакций в виде окрашенных осадков. Чтобы повысить специфичность реакций, часто применяют метод ферментативного контроля. Например, для выявления ДНК и РНК используют галлоцианин – хромовые квасцы, окрашивающие нуклеиновые кислоты в стойкий сине-фиолетовый цвет. ДНК обнаруживают с помощыо реакции Фёльгена. Срезы подвергают кислотному гидролизу (1 н НСl при 60 °C), при этом освобождаются альдегидные группировки дезоксипентозы в ДНК. Затем срезы переносят в фуксинсернистую кислоту, которая взаимодействует только с альдегидными группировками хроматина, обусловливая его пурпурную окраску. Срезы, предварительно обработанные дезоксирибонуклеазой – ферментом, расщепляющим ДНК – не окрашиваются, что подтверждает наличие в структуре ДНК.

Методами иммуноцитохимии можно идентифицировать клетки различных типов и их рецепторы по маркерным признакам, изучать синтетические и секреторные процессы. Методы основаны на обработке срезов (или мазков) специфическими антителами к выявляемому веществу, которое служит антигеном. Антитела маркируют путем конъюгации с флуоресцентными красителями, ферментами, которые затем выявляются цитохимически или электронно-плотными частицами (ферритин).

С помощью количественных гистохимических методов изучают химический состав конкретных структур клетки.

Цитоспектрофотометрия – это метод количественного и качественного изучения веществ по спектру их поглощения в структурах отдельной клетки. С его помощью можно установить суммарное содержание белков или других элементов. В основе метода лежит принцип абсорбционной спектрофотометрии. Например, с помощыо интерферометрии можно оценить сухую массу и концентрацию плотных веществ в живой и фиксированной клетке.

Метод дифференциального центрифугирования основан на применении центрифуг, развивающих скорости от 20000 до 150000 мин и более. При центрифугировании в определенных условиях, например, в сахарозе в зависимости от градиента плотности, удается отделить и осадить различные органеллы клеток: ядра, митохондрии, фракции пиноцитозных и синаптических пузырьков, рибосом и других компонентов, пригодных для гистохимического исследования.

Метод авторадиографии широко применяют для изучения кинетики клеточных популяций, метаболических процессов в клетках, и определения участков синтеза биополимеров с помощью регистрации веществ, меченых изотопами. Для этого в ткань животного или в среду с культивируемыми клетками вводят предшественников какого-либо макромолекулярного соединения (например, аминокислоты, нуклеотиды), один из атомов которого замещен радиоактивным изотопом (например, радиоактивного водорода Н углерода – С¹⁴, серы, фосфора и других). В процессе синтеза белков, гормонов, ферментов или иных веществ в них включается молекула меченого предшественника. Для регистрации места ее включения в темноте на окрашенные обычными методами срезы наносят специальную мелкозернистую фотоэмульсию, после чего срезы проявляют. На участках соприкосновения фотоэмульсии с радиоактивным веществом происходит фотореакция, в результате которой образуются засвеченные участки – метки, или треки. Этим методом можно, например, определить время перемещения клеток, меченых Н³